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电泳迁移实验 EMSA
Fri Feb 27 00:00:00 CST 2015昀冠科学商城新闻编辑
1、核蛋白的提取
①用 细 胞 刮子刮取RAW264.7细胞与VSMC，移入2.5mlEP 管中。②将细胞用冰冷PBS洗两遍，于4℃, 5000g离心3min，沉淀细胞。③加5倍细胞体积的冰浴缓冲液A洗细胞一次，于4℃,5000g离心3 min沉淀细胞.④加3倍细胞体积的冰浴缓冲液A悬浮细胞，冰上放置30 min、剧烈振荡10次，4℃,5000g离心15min，去上清，沉淀为细胞核。⑤加与细胞等体积的冰浴缓冲液B，充分混匀，冰上放置30m in后，于40℃ ,15 000g离心15min,上清为核蛋白。⑥取2ul核蛋白Bradford法测定核蛋白浓度，分装后于-70℃保存。
2.探针的标记与纯化
A、 探 针 的标记:将以下试剂加入冰浴中的0.5m l的EP管中，总体积20时。①未标记的探针:2ul (50ng);② 10 x激酶缓冲液:2g1;③ [y-32P]ATP: 4ul (40 uCi);④T4多聚核甘酸激酶:lul (10U);⑤超纯水:11ul。
B.混匀后37℃水浴30分钟;
C、加入5u1 1%SDS/100 mM EDTA短暂涡旋混匀，以终止激酶反应;
3、探针的纯化
①准 备 MicroSpin' G25分离柱;②轻轻涡旋分离柱以重悬管内树脂;③将盖子拧松1/4后去掉管底密封;④将分离管放入一只1.5mlEP管中(EP管作支撑用)⑤ 735g离心l分钟;⑥加入样品:⑦分离管放入一只新的1.5 mlEP管中，缓慢将样品加入树脂床角度平面的中央，735g离心1分钟;⑧将75ul超纯水加入分离柱，735g离心1分钟;⑨收集支撑管内纯化好的探针，小心丢弃分离管。
4,测定探针的放射活性
取1ul纯化的探针，用闪烁计数器测量其放射活性，放射活性大于1* 10 5cpm/ul示标记成功。
5,凝胶迁移阻滞法测定NF-KB
A、 按下 列 顺序分别将各反应成分加入第一套做好标记的EP管内:①结合缓冲液:4ul ②稳定液D: 2 ul;③核提取物:lug;④去离子水至:16ul.
B、用移液枪轻轻吸打混匀，4 0C下将核提取物预孵育20分钟，
C、在核提取物预孵育期间，按下列顺序依次将各成分加入做好标记的第二套EP管内:①结合缓冲液:2ul;②稳定液D:1ul;③探针:lul;④去离子水:4ul。
D、将探针棍合物加入预孵育好的核提取物混合物中，用移液器轻轻吸打混匀后，4℃继续孵育20分钟。
E,EMSA测定:预先将5%非变性丙烯酞胺胶(38:2 )和电泳缓冲液(1X TGE)预冷至4℃,然后:①将每反应管内所有反应物加入样品孔中。同时在一空白孔中加入含溟酚蓝的上样缓冲液，以观测胶的移动情况。当溟酚蓝电泳至玻璃板下1/3即可停止电泳(约2小时)。②电泳:12.5V/cm(400px玻璃板为200V)a
F、放射自显影:电泳完毕后，取出凝胶，用保鲜膜封好;将凝胶与放入有增感屏的曝光盒中，于一70℃ 放射自显影24小时。然后将X光片在显影液中显影30sec-1min，在定影中定影15-30min，清水冲洗干净后自然晾干。
G、图像分析:将各测量组的电泳照片扫描至计算机，然后应用Bandscan分析软件对电泳条带进行灰度测定，并计算平均光密度值(OD)，以各条带的OD值表示相应核转录因子的活性
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